Test ELISA - co wykrywa? Jak odczytać wyniki? Cena testu

Test ELISA wykrywa liczne choroby, dlatego znalazł szerokie zastosowanie w medycynie i nie tylko. Jednak test ELISA najbardziej znany jest jako metoda stosowana w diagnostyce choroby, jaką jest borelioza. Na czym polega test ELISA? Jak interpretować wyniki? Jaka jest cena testu?

Spis treści

1. Test ELISA - co wykrywa? Zastosowanie testu ELISA
2. Test ELISA - na czym polega to badanie?
3. Test ELISA a borelioza. Kiedy wykonać?
4. Test ELISA - wyniki. Czy mogą być fałszywie dodatnie?
5. Test ELISA - wyniki. Czy mogą być fałszywie ujemne?

Test ELISA, czyli metoda immunoenzymosorpcyjna (ang. enzyme-linked immunosorbent assay), jest powszechnie stosowaną metodą laboratoryjną, która służy m. in. do ilościowego wykrywania przeciwciał we krwi.

Z uwagi na to test ELISA znalazł zastosowanie w diagnostyce chorób o podłożu bakteryjnym, jak np. borelioza z Lyme.

Zaletą metody ELISA jest jej prostota i możliwość szybkiego wykonania oraz wysoka czułość. Metodę ELISA wykonuje się przy użyciu specjalnych plastikowych płytek z dołkami wypełnionymi np. białkami (antygenami) krętka Borrelia oraz specyficznych przeciwciał monoklonalnych, które mają za zadanie wykrycie przeciwciał w próbce od pacjenta.

Test ELISA - co wykrywa? Zastosowanie testu ELISA

Wysoka czułość i prostota wykonania metody ELISA spowodowała, że znalazła ona zastosowanie w diagnostyce wielu chorób, jednak najbardziej znana jest jako metoda diagnostyczna boreliozy z Lyme.

W przypadku diagnostyki boreliozy z Lyme stosuje się tzw. pośrednią ELISA, która pozwala na wykrycie w badanym materiale specyficznych IgM lub IgG. W analogiczny sposób przeciwciała mogą być wykrywane w celu diagnostyki:

• zakażeń wirusowych: herpeswirusami (wirus opryszczki, półpaśca, Epstein-Barr, cytomegalii), HIV, wirusami zapalenia wątroby (HBV i HCV)
• zakażeń pierwotniakami: toksoplazmoza, lamblioza
• chorób z autoagresji: celiakii (przeciwciała anty-tTG lub anty-DPG), chorobie Hashimoto (przeciwciała przeciw anty-TG i anty-TPO), nieswoistych chorobach zapalnych jelit (przeciwciała przeciw anty-ASCA i anty-ANCA)
• chorób pasożytniczych i alergii, w których wykrywa się specyficzne przeciwciała IgE. Ich podwyższony poziom może świadczyć o występowaniu alergii np. na pyłki i pokarmy lub inwazji pasożytniczej (tasiemiec uzbrojony, glista ludzka)

Istnieją także modyfikacje metody ELISA (tzw. kanapkowa ELISA), które pozwalają na wykrycie badanej próbce innych białek niż przeciwciała. Wtedy celem badania jest wykrycie w materiale biologicznym:

• fragmentów wirusów lub bakterii, najczęściej są to antygeny charakterystyczne dla danego patogenu
• hormonów w surowicy np. estrogenów, prolaktyny, TSH, fT4, kortyzolu
• enzymów np. kalprotektyny, elastazy trzustkowej, fosfatazy alkaicznej
• markerów nowotworowych, np. CA-125
• obecności leków w surowicy

Metoda ta ma również zastosowanie w przemyśle spożywczym, w którym za jej pomocą można wykrywać śladowe ilości alergenów (np. mleka, orzeszków ziemnych), GMO lub toksyn w żywności.

Test ELISA - na czym polega to badanie?

Diagnostyka np. boreliozy z Lyme za pomocą metody ELISA polega na wykryciu w materiale biologicznym białek odpornościowych – przeciwciał, które powstają w trakcie odpowiedzi przeciwko antygenom krętków Borrelia.

Przeciwciała bada się w dwóch klasach IgM i IgG. IgM są pierwszymi przeciwciałami, które pojawiają się w organizmie po kontakcie z bakterią i z upływem czasu zanikają.

Ich miejsce zajmują trwalsze przeciwciał IgG, które mogą utrzymywać się w organizmie nawet kilkadziesiąt lat.

W ten sposób pośrednio bada się obecność bakterii w ustroju poprzez wykrywanie przeciwciał skierowanych specyficznie przeciwko krętkom Borrelia.

Przeciwciała na różnych etapach zakażenia mogą być skierowane przeciwko rozmaitym białkom krętka Borrelia. Na przykład we wczesnym etapie jest to białko p41.

W późniejszych etapach białek zaczyna pojawiać się ich coraz więcej jak p21, p30, p39, p43. To powód dlaczego diagnostyka boreliozy z Lyme jest niezwykle trudna.

Dobór białek bakteryjnych jest niezmiernie istotny, aby test miał wysoką wartość diagnostyczną. Dlatego rutynowo w diagnostyce boreliozy z Lyme powinno sie stosować testy ELISA II-generacji lub III-generacji w których zestawy białek są tak wyselekcjonowane, aby uzyskać jak najbardziej wiarygodny wynik.

Test ELISA a borelioza. Kiedy wykonać?

Borelioza z Lyme jest chorobą bakteryjną powodowaną przez bakterie Borrelia burgdorferi oraz jej liczne odmiany.

Diagnostyka choroby nie jest prosta z uwagi na złożoność odpowiedzi odpornościowej przeciw krętkom Borrelia oraz niedoskonałości metod laboratoryjnych.

Najpowszechniej stosowaną metodą laboratoryjną jest wysokoczuła metoda ELISA, za pomocą której wykrywa się specyficzne przeciwciała wytworzone przeciwko białkom bakterii.

W diagnostyce boreliozy z Lyme wykorzystuje się pośrednią metodę ELISA w której wyróżnia się następujące po sobie etapy:

• inkubację dołków na płytce z materiałem pobranym od pacjenta np. surowicą. Jeśli w badanym materiale znajdują się przeciwciała przeciwko krętkom Borrelia przyłączają się one do białek na dnie dołka reakcyjnego
• następnie wypłukuje się nadmiar surowicy specjalnym płynem płuczącym (buforem) i dodaje tzw. koniugat, czyli przeciwciało połączone z enzymem, które łączy się z wcześniej połączonymi przeciwciałami w dołkach reakcyjnych
• później dodawany jest substrat dla koniugatu i zachodzi reakcja barwna (wynik pozytywny) lub jej brak (wynik negatywny)
• ostatnim etapem jest odczytanie przez czytnik (spektrofotometr) stężenia przeciwciał przeciwko krętkom Borrelia w surowicy pacjenta

Badanie metoda ELISA w kierunku boreliozy z Lyme wykonuje się z krwi, a w przypadku występowania objawów neurologicznych (neuroborelioza) również z płynu mózgowo-rdzeniowego.

Nie powinno się wykonywać oznaczeń z płynu stawowego, gdyż istnieje duże prawdopodobieństwo uzyskania wyników fałszywe dodatnich.

Podstawą rozpoznania choroby są objawy kliniczne na nią wskazujące, potwierdzone wynikiem badań laboratoryjnych.

Dodani wynik badania laboratoryjnego bez występowania objawów nie upoważnia do rozpoznania boreliozy z Lyme, ponieważ wykazano, że również u zdrowych osób wykrywa się przeciwciała przeciwko krętkom Borrelia.

Diagnostyka serologiczna boreliozy z Lyme rozpoczyna się od wykonania półilościowego przesiewowego badania ELISA. Jeśli wynik jest ujemny oznacza to, że nie wykryto krętków Borrelia lub wynik jest fałszywie ujemny.

W przypadku wyniku dodatniego lub słabo dodatniego (niejednoznaczny), należy wykonać badanie potwierdzające metodą Western blot, która charakteryzuje się wysoką swoistością.

Ma to na celu potwierdzenie „prawdziwości” uzyskanych wyników metodą ELISA. Przy diagnostyce nie można pominąć żadnego z powyższych etapów i np. od razu wykonać diagnostykę przy użyciu metody Western blot lub postawić diagnozę na podstawie samego dodatniego wyniku metodą ELISA.

W Polsce bardzo często diagnostykę boreliozy z Lyme kończy się na pierwszy etapie przesiewowym, co powoduje błędną interpretację wyników dodatnich lub słabo dodatnich.

Test ELISA - wyniki. Czy mogą być fałszywie dodatnie?

Wyniki fałszywie dodatnie wynikają z reaktywności krzyżowej najczęściej przeciwciał IgM z innymi białkami. Przeciwciała wytwarzane prze organizm mogą „nieprawidłowo” rozpoznać antygen innych mikroorganizmów jako antygen krętka Borrelia.

Do najczęstszych „pomyłek” dochodzi u osób zakażonych krętkiem bladym (łac. Treponema pallidum), herpeswirusami oraz u osób z toczniem rumieniowatym układowym i innymi chorobami reumatycznymi.

Test ELISA - wyniki. Czy mogą być fałszywie ujemne?

Wyniki fałszywie ujemne mogą pojawić się we wczesnym stadium zakażenia, wtedy badanie należy powtórzyć po około 3-4 tygodniach. Jest to tzw. okno serologiczne, czyli początkowy okres zakażenia w którym organizm jeszcze „nie zdążył” wytworzyć specyficznych przeciwciał.

Podobnie u osób z niedoborami odporności, które nie wytwarzają wystarczającej ilości przeciwciał.

Dużym problemem, szczególnie w bardzo intensywnych zakażeniach jest pojawianie się tzw. kompleksów immunologicznych, które składają się z antygenów krętków Borrelia oraz specyficznych dla nich przeciwciał.

Powoduje to, że przeciwciała stają się „niewidoczne” dla powszechnie stosowanych metod jak ELISA i mimo, że znajdują się one w badanym materiale nie mogą być wykryte.

W takich przypadkach, laboratorium może zastosować rozbijanie kompleksów immunologicznych. Zabieg ten ma na celu uwolnienie przeciwciał. Jednak metoda ta nie jest powszechnie stosowana z uwagi na brak jej standaryzacji w laboratoriach.

Piśmiennictwo

1. Witecka-Knysz E. i wsp. Borelioza: dlaczego diagnostyka jest tak trudna? Diagnosta Laboratoryjny Kwiecień 2007.2. Moore A. i wsp. Current Guidelines, Common Clinical Pitfalls, and Future Directions for Laboratory Diagnosis of Lyme Disease, United States. Emerg Infect Dis. 2016 Jul;22(7).3. Diagnostyka laboratoryjna chorób odkleszczowych Rekomendacje Grupy Roboczej: Krajowa Izba Diagnostów Laboratoryjnych, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego-Państwowy Zakład Higieny, Konsultant Krajowy w dziedzinie chorób zakaźnych, Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polskie Towarzystwo Wirusologiczne, Warszawa 20144. Hosseini S. i wsp.: Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) From A to Z. Springer 2017.

O autorze

dr n. med. Karolina Karabin, biolog molekularny, diagnosta laboratoryjny, Cambridge Diagnostics Polska

Z wykształcenia biolog ze specjalizacją mikrobiologia i diagnosta laboratoryjny z ponad 10-letnim stażem w pracy laboratoryjnej. Absolwentka Studium Medycyny Molekularnej oraz członek Polskiego Towarzystwa Genetyki Człowieka.Kierownik grantów naukowych realizowanych w Pracowni Diagnostyki Molekularnej przy Klinice Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych WUM. Tytuł doktora nauk medycznych w zakresie biologii medycznej obroniła na I Wydziale Lekarskim WUM. Autorka wielu prac naukowych i popularnonaukowych z zakresu diagnostyki laboratoryjnej, biologii molekularnej i żywienia. Na co dzień jako specjalista w zakresie diagnostyki laboratoryjnej prowadzi dział merytoryczny w Cambridge Diagnostics Polska oraz współpracuje z zespołem dietetyków w Poradni Dietetycznej CD. Ze specjalistami dzieli się praktyczną wiedzą dotyczącą diagnostyki i dietoterapii chorób na konferencjach, szkoleniach oraz na łamach czasopism i portali internetowych. Szczególnie zainteresowana wpływem współczesnego stylu życia na procesy molekularne w organizmie.

dr n. med. Karolina Karabin