PCR (badanie) - zastosowanie. Na czym polega technika PCR?

PCR to badanie, które znalazło zastosowanie w diagnostyce wielu chorób. Metoda PCR pozwala na wykazanie bezpośredniej obecności bakterii w ustroju, a konkretnie jej DNA. Badanie PCR jest wykorzystywane m.in. w diagnostyce boreliozy. Na czym polega technika PCR? Co to jest real time PCR?

Spis treści

1. PCR (badanie) - na czym polega technika PCR?
2. PCR (badanie) - zastosowanie metody PCR
3. PCR (badanie) a borelioza
4. PCR - wyniki. Czy mogą być fałszywie dodatnie?
5. PCR - wyniki. Czy mogą być fałszywie ujemnie

PCR (ang. polymerase chain reaction), czyli reakcja łańcuchowa polimerazy, jest podstawową metodą stosowaną w laboratoriach genetycznych i molekularnych. Została opracowana w 1983 roku przez Kary’ego Mullis’a, który otrzymał za to w roku 1993 Nagrodę Nobla.

PCR (badanie) - na czym polega technika PCR?

Badanie PCR polega na wielokrotnym powielaniu (zwykle w 30-40 cyklach) specyficznego fragmentu DNA, np. genów kodujących białka krętka Borrelia, za pomocą enzymu polimerazy.

Następnie w celu uwidocznienia namnożonego fragmentu DNA stosuje się specjalne barwniki molekularne. PCR, dzięki powielaniu określonych fragmentów DNA, jest metodą ultraczułą.

W metodzie PCR za pomocą specyficznych par starterów dla danego regionu DNA bakterii namnaża się fragmenty DNA. Na przykład, regiony docelowe w metodzie PCR stosowane w diagnostyce boreliozy z Lyme to geny kodujące białka m. in. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Materiał biologiczny, z jakiego można wykonywać badanie, to:

• krew
• wycinek skóry z rumienia wędrującego
• płyn mózgowo-rdzeniowy
• płyn stawowy lub z chrząstki stawowej
• mocz

PCR (badanie) - zastosowanie metody PCR

Oprócz diagnostyki boreliozy z Lyme za pomocą metody PCR można wykrywać specyficzne fragmenty DNA innych drobnoustrojów lub człowieka. Dlatego metodę PCR stosuje się również w:

• diagnostyce i monitorowaniu zakażeń wirusowych: herpeswirusami (wirus opryszczki, półpaśca, Epstein-Barr, cytomegalii), HIV, wirusami zapalenia wątroby (HBV i HCV)
• diagnostyce i monitorowaniu zakażeń bakteryjnych, szczególnie tych bakterii, których nie udaje się zidentyfikować poprzez hodowle np. gruźlica
• diagnostyce i monitorowaniu chorób nowotworowych: białaczek, raka piersi, raka jelita grubego, raka płuc
• diagnostyce predyspozycji do nowotworów: raka piersi i jajnika (geny BRCA1 i BRCA2), rak jelita grubego (geny APC i CHEK2)
• diagnostyce chorób o podłożu genetycznym: hemochromatozy (gen HFE), talasemii (geny HBA1 i HBA2), celiakii (geny HLA)
• testach na ojcostwo, w których wykrywa się zgodność DNA dziecka i ojca

PCR (badanie) a borelioza

Podstawą rozpoznania boreliozy z Lyme są badania serologiczne. Jednak istnieją sytuacje kliniczne, które powodują, że wyniki tych badań mogą być fałszywie ujemne:

• okno serologiczne, czyli początkowy okres zakażenia w którym organizm jeszcze nie wytwarza specyficznych przeciwciał IgM i IgG przeciwko krętkom Borrelia
• u osób z niedoborami odporności, które nie wytwarzają wystarczającej ilości przeciwciał
• obecność kompleksów immunologicznych, które składają się z antygenów krętków Borrelia oraz specyficznych dla nich przeciwciał i uniemożliwiają wykrycie przeciwciał za pomocą metod serologicznych

Jeśli u chorego podejrzewa się objawy boreliozy z Lyme, a wyniki badania serologicznego są ujemne można wykonać badanie molekularne oparte o metodę PCR.

DNA krętków Borrelia można wykryć we wczesnej fazie zakażenia, gdyż ilość krętków w płynach ustrojowych jest wtedy najwyższa.

W diagnostyce boreliozy z Lyme stosuje się przede wszystkim metody serologiczne jak ELISA, jednak w niektórych sytuacjach klinicznych pomocne są badania genetyczne z wykorzystaniem metody PCR.

Im dłuższy czas od zakażenia tym mniejsze prawdopodobieństwo wykrycia DNA bakterii. Dlatego w niektórych przypadkach zanim wykona się badanie metodą PCR, hoduje się bakterie na specjalnych pożywkach przez 1-2 tygodni i dopiero wykonuje badanie.

Takie podejście stosuje się w przypadku podejrzenia neuroboreliozy i pobranego płynu mózgowo-rdzeniowego. W późnej fazie zakażenia bardziej zasadne jest wykonanie badania metodą ELISA.

Metoda PCR nie powinna być wykorzystywana w rutynowej diagnostyce boreliozy z Lyme ze względu na brak standaryzacji dotyczącej występowania odmian Borrelia burgdorferi na terenie Polski.

Natomiast przy trudnościach w rozpoznaniu (szczególnie we wczesnym etapie choroby) wynik badania metodą PCR jest pomocy w procesie diagnostycznym.

Wynik pozytywny badania oznacza, że wykryto w badanym materiale obecność DNA Borrelia burgdorferi i jej odmian, jednak nie wyjaśnia to czy w organizmie toczy się aktywne zakażenie. Z kolei wynik negatywny nie wyklucza obecności bakterii w ustroju.

Niektóre laboratoria oferują badanie na obecność DNA krętków Borrelia w kleszczu. Jednak wynik takiego badania nie jest podstawą do rozpoznania boreliozy z Lyme u osoby ugryzionej.

PCR - wyniki. Czy mogą być fałszywie dodatnie?

PCR jest metodą ultraczułą i jednocześnie bardzo wrażliwą na zanieczyszczenia. Dlatego bardzo istotne w testach opartych o PCR jest dobranie odpowiedniej kontroli wewnętrznej w celu wykluczenia wyników fałszywie dodatnich.

Kluczowe również jest prawidłowe pobieranie materiału do badań oraz doświadczenie i rzetelność pracy diagnosty wykonującego badanie.

PCR - wyniki. Czy mogą być fałszywie ujemnie

Jak w każdym badaniu laboratoryjnym również w metodzie PCR mogą pojawić się wyniki fałszywie ujemne. Tutaj kluczowe jest pobranie krwi na odpowiedni antykoagulant, ponieważ niektóre z nich jak heparyna mogą zahamować reakcję PCR.

Również pobranie materiału po rozpoczęciu antybiotykoterapii może powodować spadek wydajności reakcji PCR oraz większe prawdopodobieństwo pojawienia się wyników fałszywie ujemnych.

Należy mięć również na uwadze, że bakterie Borrelia bytują bardzo krótko we krwi i płynach ciała, ponieważ dzięki specjalnym receptorom wnikają bardzo szybko do „trudno dostępnych” miejsc w organizmie.

Dlatego w przeciwieństwie do diagnostyki innych mikroorganizmów, ilość krętków Borrelia w materiale biologicznym jest niewielka, czasami nawet na granicy wykrywalności metody PCR. To również może być przyczyną wyników fałszywie ujemnych.

Piśmiennictwo

1. Dunaj J. i wsp. Znaczenie metody PCR w diagnostyce boreliozy z Lyme. Przegl. Epidemiol. 2013, 67, 119 – 123.
2. Diagnostyka laboratoryjna chorób odkleszczowych Rekomendacje Grupy Roboczej: Krajowa Izba Diagnostów Laboratoryjnych, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego-Państwowy Zakład Higieny, Konsultant Krajowy w dziedzinie chorób zakaźnych, Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polskie Towarzystwo Wirusologiczne, Warszawa 2014.
3. Ružić-Sabljić E. i Cerar T. Progress in the molecular diagnosis of Lyme disease. Expert Rev Mol Diagn. 2017 Jan;17(1):19-30.
4. Valones M.A.A. i wsp. Principles and applications of polymerase chain reaction in medical diagnostic fields: a review. Braz J Microbiol. 2009 Jan-Mar; 40(1): 1–11.

O autorze

dr n. med. Karolina Karabin, biolog molekularny, diagnosta laboratoryjny, Cambridge Diagnostics Polska

Z wykształcenia biolog ze specjalizacją mikrobiologia i diagnosta laboratoryjny z ponad 10-letnim stażem w pracy laboratoryjnej. Absolwentka Studium Medycyny Molekularnej oraz członek Polskiego Towarzystwa Genetyki Człowieka.Kierownik grantów naukowych realizowanych w Pracowni Diagnostyki Molekularnej przy Klinice Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych WUM. Tytuł doktora nauk medycznych w zakresie biologii medycznej obroniła na I Wydziale Lekarskim WUM. Autorka wielu prac naukowych i popularnonaukowych z zakresu diagnostyki laboratoryjnej, biologii molekularnej i żywienia. Na co dzień jako specjalista w zakresie diagnostyki laboratoryjnej prowadzi dział merytoryczny w Cambridge Diagnostics Polska oraz współpracuje z zespołem dietetyków w Poradni Dietetycznej CD. Ze specjalistami dzieli się praktyczną wiedzą dotyczącą diagnostyki i dietoterapii chorób na konferencjach, szkoleniach oraz na łamach czasopism i portali internetowych. Szczególnie zainteresowana wpływem współczesnego stylu życia na procesy molekularne w organizmie.

dr n. med. Karolina Karabin